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Item Efecto de la melatonina sobre la actividad de la proteína cinasa C y la distribución de filamentos intermedios en las células N1E-115(1995) Benítez-King, Gloria; Ríos, Amelia; Grimaldo, José Carlos; Antón-Tay, Fernando; Departamento de Neurofarmacología, División de Investigaciones Clínicas, Instituto Mexicano de Psiquiatría, Calz. México-Xochimilco 101 col. San Lorenzo Huipulco, 14370, México D.F.En los años recientes hemos demostrado que uno de los mecanismos de acción de la melatonina (MEL), ocurre a nivel intracelular. La hormona se une a la calmodulina con alta afinidad (188 pM) en presencia de calcio y antagoniza su actividad. Recientemente hemos encontrado que la MEL además de antagonizar la actividad de la calmodulina, activa a la proteína cinasa C (PKC) in vitro y sinergiza la estimulación producida por esteres del forbol. Esta evidencia ha sugerido que la MEL además de unirse a la calmodulina in vivo, también podría unirse a la PKC modulando su actividad. La activación de la PKC citosólica, se acompaña de su traslado al citoesqueleto y a la membrana donde fosforila a la vimentina, causando el desensamble de los filamentos intermedios (IF) y modificando el soporte y la integración del espacio intracelular, así como la transducción de señales. En este trabajo se estudió el efecto de la MEL sobre la actividad de la PKC y la distribución de los IF de vimentina en las células NIE-115. Los resultados señalaron que en condiciones basales, el 99% de actividad de la enzima se encuentra en la fracción citosólica, y que en las células incubadas con MEL 1 nM durante 5-30 min y hasta 3 y 6 hrs, la mayor actividad se encuentra en la fracción citoesqueleto-membranal. Estos resultados sugieren que la hormona activa a la PKC y la traslada del citosol a la membrana y al citoesqueleto. También, por inmunofluorescencia de doble marcaje, se encontró que la MEL modificó la distribución subcelular de la PKC. En las células de neuroblastoma incubadas con 1 nM de la hormona, la enzima se detectó en estructuras filamentosas cortas, en tanto que en las células incubadas con el vehículo la PKC se encontró en estructuras filamentosas delgadas y con un patrón de fluorescencia difuso. Junto con los cambios en la distribución y la actividad de la PKC, se observó que la MEL modificó la estructura de los IF. En las celulas incubadas con la hormona, los IF de vimentina se observaron como estructuras filamentosas cortas, rectas y mucho menos densas que en las células incubadas con vehículo, en donde los IF se observaron como estructuras fibrosas onduladas poblando densamente al citoplasma y orientadas del núcleo a la periferia celular. Estos resultados indican que la MEL in vivo, además de unirse a la calmodulina es capaz de interaccionar con otras proteínas intracelulares con actividad funcional y corroboran que la hormona podría modular la actividad de sus células blanco a través de la fosforilación de proteínas. Los resultados también apoyan la hipótesis de que la MEL sincroniza la actividad celular con el fotoperiodo por medio de la modulación cíclica de la arquitectura celular.Item Estudio de liberación in vitro de péptidos opioides en terminales nerviosas aisladas(1995) Asai, Miguel; Agustín, Pablo; Benítez-King, Gloria; Laboratorio de Análisis Químicos. División de Neurociencias. Instituto Mexicano de Psiquiatría, Calz. México-Xochimilco 101, col. San Lorenzo Huipulco 14370, México, D.F.Actualmente se reconoce el papel modulador de los péptidos opioides en la homeostasis celular. Los péptidos opioides se han detectado por microscopia electrónica en vesículas electrodensas de las terminales nerviosas. También, se ha establecido que la liberación in vitro de encefalinas, a partir de rebanadas del cuerpo estriado es dependiente de calcio y se produce por la presencia de potasio como agente despolarizante. No obstante, los mecanismos moleculares que subyacen en la liberación de encefalinas no se conocen. Se sabe que el complejo calcio-calmodulina (Ca2+-CaM), participa en la liberación de neurotransmisores por la activación de la multiproteína cinasa II (MPKII). También se conoce que la proteína cinasa C (PKC), cuando es activada por PMA (éster de forbol), fosforila a la GAP-43 y a las MARCS presentes en las membranas de las vesículas sinápticas promoviendo la exocitosis. En el presente trabajo, se estudió la posible participación de la calmodulina (CaM) y PKC en la liberación in vitro de péptidos opioides, en terminales nerviosas aisladas (sinaptosomas), obtenidas de la amígdala del lóbulo temporal de la rata y se utilizó a la trifluoroperazina (TFP) y al compuesto W7 como antagonistas de la CaM y a un éster de forbol, el PMA como activador de la PKC. Un grupo de ratas macho de la cepa Wistar (200-250 g), se sacrificaron por decapitación, el cerebro se removió con rapidez y la amígdala se disecó y se colocó en sacarosa 0.32 M a 4°C. Una vez obtenidos los sinaptosomas se realizaron los experimentos de liberación, utilizando potasio (55 mM) como agente despolarizante y al dipéptido Phe-Ala (1 mM) como inhibidor de la encefalinasa. La recolección de las muestras se realizó cada 5 min (liberación basal, alto potasio y postestímulo). La concentración de IR-met-encefalina, IR-leu-encefalina, IR-ME-Arg6-Phe7 e IR-ME-Arg6-Gly7-leu8 fue medida con la técnica de radioinmunoensayo. Los resultados señalaron que el EGTA a una concentración de 1 mM, redujo significativamente la liberación de opioides (65%). La presencia del TFP y W7 en un margen micromolar redujo significativamente la liberación de met-encefalina, hepta y octapéptido; sin embargo, no tuvieron efecto sobre la liberación de leu-encefalina. Por el contrario, el PMA (1 µ M) aumentó significativamente la liberación de leu-encefalina (67%), pero no modificó la liberación evocada de met-encefalina. Los resultados indican que los péptidos opioides se liberan presinápticamente a partir de sus terminales nerviosas, su secreción es dependiente de calcio y de naturaleza selectiva. El complejo Ca2+ -CaM podría regular la liberación de met-encefalina, heptapéptido y del octapéptido y la PKC la liberación de leu-encefalina.Item Efecto de la melatonina sobre la actividad de la proteína cinasa C y la multiproteína cinasa II dependiente de calmodulina(1994) Benítez-King, Gloria; Huerto-Delgadillo, Lourdes; Martínez Hernández, Aída; Antón-Tay, Fernando; Departamento de Neurofarmacología. división de Investigaciones Clínicas, Instituto Mexicano de Psiquiatría. Calz. México-Xochimilco 101, San Lorenzo Huipulco, 14370 México.La melatonina actúa como un regulador cronobiológico en los vertebrados, invertebrados y en el ser humano, sincronizando la actividad biológica del organismo con el ciclo luz-oscuridad. De ahí que se ha sugerido que la hormona tiene un papel importante en la fisiopatología de las enfermedades psiquiátricas que se presentan con alteraciones de los ritmos circadianos. En la actualidad, el conocimiento acerca del efecto modulador de la melatonina sobre la fisiología celular se encuentra en expansión, aun cuando la información sobre su mecanismo de acción es escasa. Hay evidencia que indica que la melatonina actúa a nivel celular por medio de varios mecanismos. Uno de ellos, propuesto por nuestro grupo, involucra la modulación intracelular de la actividad de la calmodulina por la melatonina. La calmodulina modula directa o indirectamente un amplio espectro de funciones celulares. En forma directa, activando enzimas tales como la fosfodiesterasa, la adenilato ciclasa, etc. e indirectamente, modulando la fosforilación de sustratos especificos al activar a la multiproteína cinasa II. Esta enzima fosforila una gran variedad de sustratos regulando funciones tales como el metabolismo de lípidos y carbihidratos, la sínteis y liberación de neurotransmisores, la funcionalidad del citoesqueleto, la homeostasis del calcio, y la expresión genética. En este trabajo se estudió el efecto de la melatonina sobre la actividad de la multiproteína cinasa II Ca2+-Calmodulina dependiente. Además, como se ha descrito que otros antagonistas de calmodulina (trifluoperazina y compuesto W-7) inhiben a la proteína cinasa C, se estudiaron los efectos de la hormona sobre la actividad de esta enzima. Los resultados obtenidos señalaron que las concentraciones fisiológicas de la melatonina inhiben la ctividad de la multiproteína cinasa II en un 40% (p < 0.01) y activan directamente a la proteína cinasa C (p < 0.007), en contraste con los antagonistas de la calmodulina (trifluoperazina y W-7), que inhiben la actividad de ambas enzimas. Estos datos confirman que la melatonina actúa como un antagonista de la calmodulina al inhibir la actividad de la multiproteína cinasa II y sugieren que la hormona es también capaz de unirse intracelularmente a otras proteínas funcionales, modulando su actividad. La melatonina podría sincronizar la actividad celular con el fotoperíodo por medio de una modulación selectiva de la fosforilación de proteínas y probablemente modula las respuestas desencadenadas por segundos mensajeros al actuar como un enlace de información cruzada entre dos caminos de traducción de señales, el del calcio y el del fosfatidil inositol.Item La trifluoperazina aumenta la concentración intracelular de calcio en neuronas de Helix aspersa(1993) Cruzblanca, Humberto; Márquez Gamiño, Sergio; Alvarez-Leefmans, Francisco Javier; División de Investigaciones en Neurociencias. Calz. México-xochimilco 101. col. San Lorenzo huipulco, 14370 México, D.F.Previamente reportamos que en las neuronas de Helix aspersa, la trifluoperazina (TFP) incrementa la inactivación de la corriente de calcio disparada por le Ca2+. En el presente trabajo se evaluó su efecto sobre la concentración intracelular de calcio iónico ([Ca2+]i) y sobre la velocidad de relajación de las corrientes de bario. Las corrientes de bario se registraron con la técnica de fijación de voltaje con dos microelectrodos. La [Ca2+)i] se estimó por microscopia de fluorescencia, utilizando como indicador intracelular a la molécula fluorescente Fura-2. La TFP incrementó la velocidad de relajación de la corriente de bario corfirmando que incrementa la inactivación de los canales de calcio aun cuando estos sean permeados por Ba2+. La TFP provocó un incremento oscilatorio de la [Ca2+]i probablemente debido a la inhibición de la bomba de Ca2+, que lo acumula activamente en el interior del retículo endoplásmico. Los resultados muestran que además de su acción antidopaminérgica, la TFP incrementa la [Ca2+]i. Dicho incremento puede contribuir a la inactivación de los canales de calcio.Item El papel de la melatonina como modulador de la organización del citoesqueleto(2000) Benítez-King, Gloria; Departamento de Neurofarmacología. Instituto Mexicano de Psiquiatría. División de Investigaciones Clínicas. Calz. México-Xochimilco 101, San Lorenzo-Huipulco, 14370 México, D. F.La melatonina (MEL) es uno hormona lipofílica que cruza las membranas biológicas y que causa múltiples respuestas fisiológicas en diversos organismos de la escala filogenética. Su función principal es la de sincronizar la actividad biológica con el ciclo luz-oscuridad. Recientemente, se ha descrito que la hormona también funciona como un captador de radicales libres. El mecanismo de acción que subyace a los efectos pleiotrópicos de la MEL no se conoce con exactitud. Se ha descrito que la hormona actúa por medio de tres mecanismos de acción: la (MEL) se une a receptores membranales acoplados a las vías de señalamiento de la adenilato ciclasa y de la fosfolipasa C; la MEL se une a proteínas nucleares que pertenecen a la familia de los receptores retinoidales; y la MEL se une y modula la actividad de la calmodulina (CaM) y de la proteína cinasa C (PKC). Este último mecanismo de acción de al MEL se relaciona con algunos aspectos de la fisiología celular filogenéticamente conservados, tales como la modulación del arreglo del citoesqueleto. En este artículo de revisión se presenta la evidencia que apoya que la MEL modula la organización de los principales componentes del citoesqueleto; microtúbulos, microfilamentos y filamentos intermedios. Además se describe el conocimiento aacumulado hasta la fecha sobre los mecanismos celulares básicos que subyacen a esta respuesta y las posibles implicaciones funcionales.