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Item Estudio de liberación in vitro de péptidos opioides en terminales nerviosas aisladas(1995) Asai, Miguel; Agustín, Pablo; Benítez-King, Gloria; Laboratorio de Análisis Químicos. División de Neurociencias. Instituto Mexicano de Psiquiatría, Calz. México-Xochimilco 101, col. San Lorenzo Huipulco 14370, México, D.F.Actualmente se reconoce el papel modulador de los péptidos opioides en la homeostasis celular. Los péptidos opioides se han detectado por microscopia electrónica en vesículas electrodensas de las terminales nerviosas. También, se ha establecido que la liberación in vitro de encefalinas, a partir de rebanadas del cuerpo estriado es dependiente de calcio y se produce por la presencia de potasio como agente despolarizante. No obstante, los mecanismos moleculares que subyacen en la liberación de encefalinas no se conocen. Se sabe que el complejo calcio-calmodulina (Ca2+-CaM), participa en la liberación de neurotransmisores por la activación de la multiproteína cinasa II (MPKII). También se conoce que la proteína cinasa C (PKC), cuando es activada por PMA (éster de forbol), fosforila a la GAP-43 y a las MARCS presentes en las membranas de las vesículas sinápticas promoviendo la exocitosis. En el presente trabajo, se estudió la posible participación de la calmodulina (CaM) y PKC en la liberación in vitro de péptidos opioides, en terminales nerviosas aisladas (sinaptosomas), obtenidas de la amígdala del lóbulo temporal de la rata y se utilizó a la trifluoroperazina (TFP) y al compuesto W7 como antagonistas de la CaM y a un éster de forbol, el PMA como activador de la PKC. Un grupo de ratas macho de la cepa Wistar (200-250 g), se sacrificaron por decapitación, el cerebro se removió con rapidez y la amígdala se disecó y se colocó en sacarosa 0.32 M a 4°C. Una vez obtenidos los sinaptosomas se realizaron los experimentos de liberación, utilizando potasio (55 mM) como agente despolarizante y al dipéptido Phe-Ala (1 mM) como inhibidor de la encefalinasa. La recolección de las muestras se realizó cada 5 min (liberación basal, alto potasio y postestímulo). La concentración de IR-met-encefalina, IR-leu-encefalina, IR-ME-Arg6-Phe7 e IR-ME-Arg6-Gly7-leu8 fue medida con la técnica de radioinmunoensayo. Los resultados señalaron que el EGTA a una concentración de 1 mM, redujo significativamente la liberación de opioides (65%). La presencia del TFP y W7 en un margen micromolar redujo significativamente la liberación de met-encefalina, hepta y octapéptido; sin embargo, no tuvieron efecto sobre la liberación de leu-encefalina. Por el contrario, el PMA (1 µ M) aumentó significativamente la liberación de leu-encefalina (67%), pero no modificó la liberación evocada de met-encefalina. Los resultados indican que los péptidos opioides se liberan presinápticamente a partir de sus terminales nerviosas, su secreción es dependiente de calcio y de naturaleza selectiva. El complejo Ca2+ -CaM podría regular la liberación de met-encefalina, heptapéptido y del octapéptido y la PKC la liberación de leu-encefalina.Item Efecto de la melatonina sobre la actividad de la proteína cinasa C y la multiproteína cinasa II dependiente de calmodulina(1994) Benítez-King, Gloria; Huerto-Delgadillo, Lourdes; Martínez Hernández, Aída; Antón-Tay, Fernando; Departamento de Neurofarmacología. división de Investigaciones Clínicas, Instituto Mexicano de Psiquiatría. Calz. México-Xochimilco 101, San Lorenzo Huipulco, 14370 México.La melatonina actúa como un regulador cronobiológico en los vertebrados, invertebrados y en el ser humano, sincronizando la actividad biológica del organismo con el ciclo luz-oscuridad. De ahí que se ha sugerido que la hormona tiene un papel importante en la fisiopatología de las enfermedades psiquiátricas que se presentan con alteraciones de los ritmos circadianos. En la actualidad, el conocimiento acerca del efecto modulador de la melatonina sobre la fisiología celular se encuentra en expansión, aun cuando la información sobre su mecanismo de acción es escasa. Hay evidencia que indica que la melatonina actúa a nivel celular por medio de varios mecanismos. Uno de ellos, propuesto por nuestro grupo, involucra la modulación intracelular de la actividad de la calmodulina por la melatonina. La calmodulina modula directa o indirectamente un amplio espectro de funciones celulares. En forma directa, activando enzimas tales como la fosfodiesterasa, la adenilato ciclasa, etc. e indirectamente, modulando la fosforilación de sustratos especificos al activar a la multiproteína cinasa II. Esta enzima fosforila una gran variedad de sustratos regulando funciones tales como el metabolismo de lípidos y carbihidratos, la sínteis y liberación de neurotransmisores, la funcionalidad del citoesqueleto, la homeostasis del calcio, y la expresión genética. En este trabajo se estudió el efecto de la melatonina sobre la actividad de la multiproteína cinasa II Ca2+-Calmodulina dependiente. Además, como se ha descrito que otros antagonistas de calmodulina (trifluoperazina y compuesto W-7) inhiben a la proteína cinasa C, se estudiaron los efectos de la hormona sobre la actividad de esta enzima. Los resultados obtenidos señalaron que las concentraciones fisiológicas de la melatonina inhiben la ctividad de la multiproteína cinasa II en un 40% (p < 0.01) y activan directamente a la proteína cinasa C (p < 0.007), en contraste con los antagonistas de la calmodulina (trifluoperazina y W-7), que inhiben la actividad de ambas enzimas. Estos datos confirman que la melatonina actúa como un antagonista de la calmodulina al inhibir la actividad de la multiproteína cinasa II y sugieren que la hormona es también capaz de unirse intracelularmente a otras proteínas funcionales, modulando su actividad. La melatonina podría sincronizar la actividad celular con el fotoperíodo por medio de una modulación selectiva de la fosforilación de proteínas y probablemente modula las respuestas desencadenadas por segundos mensajeros al actuar como un enlace de información cruzada entre dos caminos de traducción de señales, el del calcio y el del fosfatidil inositol.Item Modulación del citoesqueleto microtubular por la interacción de melatonina con calmodulina: sus posibles implicaciones fisiológicas(1993) Benítez-King, Gloria; Huerto-Delgadillo, Lourdes; Antón Tay, Fernando; Departamento de Neurofarmacología, División de Investigaciones Clínicas, Instituto Mexicano de Psiquiatría. Calz. México-Xochimilco 101, Col. San Lorenzo-Huipulco 14370 México, D.F.Varios ritmos corporales se acoplan al fotoperiodo a través de la secreción rítmica de la hormona melatonina. Algunos trastornos mentales se han relacionado con modificaciones del rítmo de secreción de la melatonina por la pineal. El mecanismo a nivel celular por medio del cual la melatonina sincroniza los diferentas ritmos corporales no se conoce con exactitud. Recientemente se ha sugerido que la melatonina al actuar como un antagonista de la calmodulina, modula la dinámica de polimerización de los microtúbulos. Esta regulación a su vez explicaría el efecto de la hormona sobre la liberación de neurotransmisores y el transporte axoplásmico en el sistema nervioso central. El ensamble de los microtúbulos es un proceso dinámico que es inhibido por el sistema Ca2+/Calmodulina tanto in vivo como in vitro. Los antagonistas de calmodulina previenen esta inhibición por unión a la calmodulina activada por el calcio, bloqueando de esta manera la formación del complejo Ca2+/Calmodulina/tubulina/MAPs. La melatonina se une a la calmodulina y produce un alargamiento de los microtúbulos y el crecimiento de neuritas in vivo, sugiriendo que tiene un efecto antagonista sobre la actividad de la calmodulina. En este trabajo, estudiamos el efecto de la melatonina sobre la polimerización de microtúbulos in vitro. El ensayo de polimerización se llevó a cabo con tubulina purificada por dos ciclos de polimerización-despolimerización (6 mg/ml). La mezcla de reacción se incubó a 30° C. La polimerización se inició con la adición de GTP. Los cambios en la absorbancia se registraron a 350 nM cada 2 minutos. En condiciones control, la polimerización de microtúbulos progresó linealmente después de un tiempo de latencia de 2 minutos y alcanzó el equilibrio a los 20 minutos de iniciada la reacción. La velocidad de polimerización calculada en la fase lineal fue de 0.014 O.D./min. En presencia de 5 µM de calmodulina y 1 mM de CaCl2, la velocidad de polimerización disminuyo a 0.004 O.D./minuto, el periodo de latencia se alargo a 4 minutos y la polimerización se inhibió un 40% con respecto al control. Se observó que la melatonina 10-9 M, previno completamente el efecto inhibitorio de Ca2+/Calmodulina sobre la polimerización de los microtúbulos de manera semejante a dos antagonistas de calmodulina (10-5 M de trifluoperazina y 1 µg/ml de compuesto 48/80). Estos resultados apoyan que los rearreglos en el citoesqueleto inducidos por melatonina son mediados por su efecto antagonista sobre calmodulina.Item Caracterización de la unión melatonina-calmodulina(1992) Benítez-King, Gloria; Chávez, José Luis; Huerto-Delgadillo, Lourdes; Antón Tay, Fernando; Departamento de Neurofarmacología, División de Investigaciones Clínicas. Instituto Mexicano de Psiquiatría, Calz. México-Xochimilco 101. Col. San Lorenzo Huipulco, 14370 México, D.F.Se ha sugerido que la melatonina está involucrada en la etiología y la fisiopatología de los trastornos afectivos. Sin embargo, no se sabe el papel que juega en estos padecimientos debidos a que aún se desconoce su mecanismo de acción. La melatonina se une a sitios de alta afinidad en varias regiones del cerebro y en órganos periféricos. Algunos receptores de la melatonina están acoplados al sistema de la adenilato ciclasa o al del diacilglicerol, traduciendo la señal de la hormona al medio intracelular. Recientemente hemos descrito que en las células MDCK y NIE-115, la melatonina induce cambios en el citoesqueleto, así como en la proliferación celular. Estos cambios están asociados con las modificaciones en los niveles y la distribución subcelular de la calmodulina. Además, la melatonina inhibe la actividad de la fosfodiesterasa dependiente de Ca++-calmodulina con una IC50 de 1 nM. Estos resultados sugirieron la hipótesis de que la señal de la melatonina podría ser percibida por la calmodulina y a través de la modificación de los niveles, distribución subcelular y actividad funcional de esta proteína: se traduciría la señal de la hormona al medio intracelular. En el presente trabajo, caracterizamos la unión de la melatonina a la calmodulina con un método de ultrafiltración rápida. La melatonina se asocia a la calmodulina con alta afinidad, dicha unión es específica, rápida, estable y reversible. Los estudios de saturación demostraron que la melatonina-H3 se une a un solo sitio en la calmodulina con una constante de afinidad (Kd) de 0.398 nM y una capacidad de unión (Bmax) de 6.25 nM/mg de calmodulina. La unión específica se incrementa 4.8 veces en presencia de calcio. Los resultados confirman la asociación de la melatonina con la calmodulina, y por lo tanto apoyan la hipótesis de que la hormona ejerce sus acciones farmacológicos y fisiológicas a través de su interacción con esta proteína.Item Efecto de la melatonina sobre la concentración y la actividad de la calmodulina(1990) Benítez-King, Gloria; Huerto-Delgadillo, Lourdes; Sámano-Coronel, Lucía; Antón-Tay, Fernando; Depto. Neurofarmacología, División de Investigaciones Clínicas, Instituto Mexicano de Psiquiatría. Calz. México-Xochimilco 101, Tlalpan, 14370, México, D.F.La melatonina es una hormona secretada por la glándula pineal que sincroniza la actividad biológica del medio interno con el fotoperiodo. A la fecha se desconoce su mecanismo de acción a nivel molecular, sin embargo se ha sugerido que la hormona tiene efectos tanto citoplasmáticos como nucleares ya que modifica la estructuración del citoesqueleto microtubular y microfilamentoso en células en cultivo, inhibe la proliferación celular y es captada por el núcleo en las células blanco. Dado que la melatonina modifica varias actividades celulares que son reguladas por la calmodulina, en este trabajo se estudio: la union de melatonina a calmodulina; la modificación de la actividad de la fosfodiesterasa; y los efectos de la melatonina sobre la concentración de calmodulina y la incorporación de timidina-H3 en las células MDCK, 3T3 y N1E-115. Los resultados obtenidos muestran que la melatonina produce un incremento en la concentración de la calmodulina y la incorporación de timidina-H3 a los tres dias de cultivo y un decremento en estos parámetros a los seis dias de cultivo. Además, la melatonina inhibe la actividad de la fosfodiesterasa dependiente de calcio calmodulina con un IC50 de 1x10-9 M. Estos resultados apoyan la hipótesis de que la melatonina regula la actividad celular a través de la modulación de calmodulina.Item El efecto de la melatonina sobre la fosforilación de proteínas en una preparación de sinaptosomas del hipotálamo de la rata(1998) Hernández, Ma. Eugenia; Galicia, Lourdes; Antón-Tay, Fernando; Benítez-King, Gloria; Instituto Mexicano de Psiquiatría, Depto. Neurofarmacología, DIC., México-Xochimilco 101, Col. San Lorenzo Huipulco, 14370, México, D.F.Hay evidencias de que la melatonina podría participar en la patofisiología de algunas enfermedades mentales. Esta hormona modifica la síntesis y liberación de neurotransmisores en el sistema nervioso central. La fosforilación de proteínas desempeña un papel crucial en la fisiología neuronal. En particular, la fosforilación de la sinapsina I por la cinasa II dependiente de calmodulina, modula el transporte de las vesículas y la liberación de los neurotransmisores en la terminal sináptica. Recientemente se describió que la melatonina in vitro inhibe la actividad y la autofosforilación de la cinasa II dependiente de la calmodulina. Como una primera etapa para entender el mecanismo por medio del cual la melatonina modula la liberación de neurotransmisores, en este trabajo se estudiaron los efectos de la hormona sobre la fosforilación de proteínas en una preparación de sinaptosomas obtenidos del hipotálamo de la rata. Los resultados señalaron que los sinaptosomas despolarizados con concentraciones altas de potasio liberaron 3H-GABA y aumentaron la fosforilación de las proteínas en un 50 %. La melatonina (1 nM) inhibió la fosforilación de las proteínas de peso molecular de 50,54,58-60 y 87 kd en sinaptosomas basales (30 %) y despolarizados con concentraciones altas de potasio (50 %). Los resultados sugieren que la hormona, al actuar como un antagonista de calmodulina e inhibir la fosforilación de proteínas, puede modular la liberación de neurotransmisores.